買(mǎi)回來(lái)之后，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)熒光標(biāo)記信號(hào)果然很強(qiáng)，穩(wěn)定性也比之前的FITC、TRITC好多了，543nm的激光器激發(fā)Alexa 568雖然效率不是很高，但是把激光器能量打滿(mǎn)，檢測(cè)器的增益調(diào)高一點(diǎn)，信號(hào)還是很OK的?？勺鯢RET AB的時(shí)候，卻發(fā)現(xiàn)本應(yīng)發(fā)生FRET效應(yīng)的兩個(gè)標(biāo)記在漂白了Alexa 568之后，Alexa 488的信號(hào)并沒(méi)有增強(qiáng)，當(dāng)時(shí)也是百思不得其解，再咨詢(xún)了其他有FRET經(jīng)驗(yàn)的老師，他們說(shuō)，有時(shí)候二抗的空間構(gòu)象也會(huì)影響FRET的效果，而且FRET AB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確實(shí)也不太穩(wěn)定，重復(fù)性也不高，好在當(dāng)時(shí)通過(guò)其他的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了我們研究的兩個(gè)蛋白確實(shí)有相互作用，這個(gè)數(shù)據(jù)不放進(jìn)去也能夠說(shuō)明問(wèn)題，也就沒(méi)有過(guò)多的深究了。

畢業(yè)之后，進(jìn)入了徠卡當(dāng)了一名技術(shù)支持，接觸的東西多了，才發(fā)現(xiàn)隨著熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和不同熒光染料的開(kāi)發(fā)，在做熒光成像的時(shí)候，有太多熒光標(biāo)記可以選擇了，但很多客戶(hù)受限于購(gòu)買(mǎi)共聚焦顯微鏡時(shí)選擇的有限的幾根激光譜線(xiàn)，導(dǎo)致有很多熒光標(biāo)記無(wú)法使用，使得有時(shí)候在寬場(chǎng)熒光顯微鏡上能夠使用的染料在共聚焦上反倒效果不好了。

當(dāng)時(shí)經(jīng)典的激光光源通常僅提供單一的窄帶發(fā)射。有些氣體激光器可以同時(shí)發(fā)射幾種光線(xiàn)，最常見(jiàn)的例子就是氬離子激光器，在藍(lán)綠范圍內(nèi)可以提供5條譜線(xiàn)（458、476、488、496、514 nm）。有些固體激光器雖然可以調(diào)節(jié)波長(zhǎng)，但僅適用紅外波段（例如用于雙光子成像的Ti:Sa激光器），除了高度精密和極其昂貴之外，它們同一時(shí)間僅能發(fā)射單一波長(zhǎng)的光線(xiàn)，而且調(diào)節(jié)波長(zhǎng)的過(guò)程非常緩慢（需要好幾秒）。

到了2008年，徠卡基于其強(qiáng)大的研發(fā)能力和厚實(shí)的專(zhuān)有技術(shù)基礎(chǔ)，推出了第一款配備超連續(xù)光譜激光器的共聚焦顯微鏡TCS SP5X，可以選擇470-670nm范圍內(nèi)任意波長(zhǎng)作為激發(fā)譜線(xiàn)，好家伙，相當(dāng)于一次性提供了足足201根激光器。借助200納米的自由調(diào)節(jié)激發(fā)線(xiàn)，可以讓當(dāng)時(shí)絕大多數(shù)的染料發(fā)揮出最佳激發(fā)性能。這種靈活性對(duì)于需要為各種應(yīng)用方向的用戶(hù)提供各種樣品和染料的成像平臺(tái)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。不僅如此，借助專(zhuān)有技術(shù)的AOBS聲光分光器，能夠最多提供8條譜線(xiàn)同時(shí)激發(fā)。

在學(xué)習(xí)新產(chǎn)品的過(guò)程中，有一個(gè)案例讓我眼前一亮，這不就是我的例子么，要是當(dāng)時(shí)遇見(jiàn)白激光這樣的神器，我也能成為案例里的“張三"了。來(lái)自于Genoa的Caorsi V和Diaspro A當(dāng)時(shí)也是拿Alexa 488和Alexa 568這樣一對(duì)供體-受體組合做FRET AB，他們一開(kāi)始也采用543nm的氦氖（HeNe）激光來(lái)漂白受體Alexa 488。根據(jù)公開(kāi)的激發(fā)光譜數(shù)據(jù)顯示，供體Alexa 488對(duì)于543nm激光的吸收率足夠低（不到2%），因此不會(huì)干擾受體漂白。這二位和我一樣，實(shí)驗(yàn)按照上述方法進(jìn)行，結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)到供體信號(hào)增加，因此可以得出結(jié)論，蛋白質(zhì)并非“共定位"且至少相隔10納米。

然而不一樣的結(jié)局是，他們經(jīng)過(guò)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在活體細(xì)胞中，供體Alexa 488對(duì)543nm的吸收率大約為11%，也就是說(shuō)，用543nm漂白受體的時(shí)候，供體也會(huì)被漂白。而使用580nm激光對(duì)該受體進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，供體發(fā)射增加了約三分之一，F(xiàn)RET效率達(dá)到了32%。580nm距離供體激發(fā)足夠遠(yuǎn)，因此供體在受體漂白期間不會(huì)受到漂白，并可在FRET受體漂白后發(fā)出更多熒光（圖一）?？梢?jiàn)使用白激光靈活調(diào)節(jié)激發(fā)波長(zhǎng)的特性，能夠有效避開(kāi)串色，從而獲得更精準(zhǔn)的FRET結(jié)果。

圖一 FRET AB測(cè)量。FRET效率可以通過(guò)測(cè)量受體光漂白之后的供體發(fā)射增加獲得。上圖：在使用傳統(tǒng)激光器時(shí)，供體發(fā)射沒(méi)有增加（左側(cè)的綠色圖片）；下圖：受體采用白激光將波長(zhǎng)調(diào)節(jié)到580nm漂白受體后，供體熒光明顯增強(qiáng)（圖片來(lái)自：Caorsi V, Diaspro A, Genoa）

看到自家的產(chǎn)品解決了當(dāng)年困擾自己的難題，既遺憾當(dāng)初我怎么沒(méi)碰到這么好的機(jī)遇，又慶幸技術(shù)的突破給眾多科學(xué)工作者帶來(lái)了解決問(wèn)題的曙光。

白激光除了精準(zhǔn)激發(fā)、有效避免串色之外，還有很多特性和應(yīng)用。敬請(qǐng)期待我們后續(xù)的推送吧。